猪圆环病毒

猪圆环病毒(Porcine circoviruses，PCV)是单股环状的DNA病毒，基因组长度约为1.7kb长，是最小的动物病毒之一。已经确定有两种类型的PCV，即圆环病毒1型(PCV1)和圆环病毒2型(PCV2)。

PCV1对猪只没有致病性，PCV2于1998年首次报道，其在临床条件下能引起猪只的猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus associated diseases，PCVAD)，主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、肺炎、猪皮炎和肾病综合征和繁殖障碍，主要表现为呼吸、泌尿、肠道、淋巴、心血管、神经、繁殖系统以及皮肤的功能紊乱，对全世界的生猪养殖造成了重大的经济损失。

调查数据表明：目前各规模猪场圆环病毒相关疾病（PCVAD）的平均经济损失，最低为34.33元，还不包括圆环病毒疫病爆发导致的损失。（数据来源：规模猪场圆环病毒相关病（PCVAD）经济损失评估报告，第四次猪病学研讨会会议论文集）

协同感染是PCV2致病性的主要起因 ，副猪嗜血杆菌、PRRSV和猪支原体肺炎在实验和田间条件下都会加剧与PCV2相关的损伤，增加PCVAD的发生率。

疫苗在猪圆环病毒病的防控起到非常重要的作用，2010年，普莱柯率先上市了国内首个猪圆环病毒疫苗。目前，有33家圆环疫苗生产厂家取得了批准文号，10种疫苗类型中，以不同毒株的全病毒圆环灭活疫苗为主，而基因工程疫苗则是疫苗企业争相研发的风向标，除了2017年11月隆重上市的“圆柯欣”外，9家企业正在开发9种不同的圆环基因工程苗。

为什么研发重点由全病毒圆环灭活疫苗转为基因工程亚单位疫苗了呢？全病毒灭活疫苗，因圆环病毒培养难度高、不同批次间病毒培养滴度差异明显、抗原灭活过程会损害抗原的免疫原性以及抗原未进行纯化等原因，一般需进行二次免疫才能达到理想效果且会存在一定的免疫副反应。基因工程亚单位疫苗只包含Cap蛋白，不仅免疫原针对性强，而且抗原含量高、纯度高，免疫剂量和次数都有减少，因此越来越受到养殖户青睐。

国内首个纯病毒样颗粒猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗（大肠杆菌源）——“圆柯欣”又有怎样的新特点呢？猪圆环病毒病毒样颗粒疫苗是通过把猪圆环病毒的主要抗原基因导入到表达载体中进行高效表达，然后把表达的免疫原性蛋白（CAP蛋白）组装成病毒样颗粒而制成的基因工程亚单位疫苗。与传统猪圆环病毒灭活疫苗相比，猪圆环病毒病毒样颗粒疫苗具有不可比拟的优点。

“圆柯欣”上市发布会后，业内国内外多位猪病防控专家对其进行了热烈讨论。

焦点一：病毒样颗粒应用于圆环疫苗有何优势？

病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs）是由病毒单一或多个结构蛋白自行装配而成的高度结构化的蛋白质颗粒，保持了病毒抗原蛋白的天然构象，因而具备激发宿主先天和适应性免疫反应功能。在形态上，VLPs 类似未成熟的病毒粒子，但是由于缺乏调节蛋白和感染性核酸，无复制和感染能力。在过去的三十年中，病毒样颗粒技术应用逐渐广泛，尤其在疫苗领域。

区别于昆虫细胞/杆状病毒系统的VLPs体内组装，VLPs的体外组装可以很好的避免细胞内其它蛋白、核酸的干扰，组装出更均一的VLPs。

病毒样颗粒具有安全性更高、免疫原性更强、副反应更小、操作更方便等诸多优势。猪圆环病毒病毒样颗粒疫苗选用的是猪圆环病毒的一段主要抗原基因制备而成，没有选用全病毒，这样就避免了全病毒灭活疫苗在病毒培养过程中造成的异源病原污染风险和由于病毒灭活不彻底而造成散毒的风险。疫苗中的有效抗原是组装成病毒样颗粒的CAP蛋白，其病毒样颗粒与天然猪圆环病毒的空间构象及其相似，可以通过和天然病毒感染机体一样的途径递程免疫细胞，诱导全面的体液免疫和细胞免疫反应，免疫原性明显优于传统灭活疫苗。在制备过程中采用在原核表达系统中表达的CAP蛋白制备抗原，没有培养全病毒、这样就有效解决了猪圆环病毒灭活疫苗在培养病毒过程中血清蛋白、细胞碎片和在灭活过程中灭活剂等成分造成的免疫副反应过大的困扰。该疫苗仔猪只需免疫1次，每次只需免疫1毫升，而传统猪圆环病毒灭活疫苗仔猪需要免疫2次，每次需要免疫2ml。不但降低了免疫次数，而且减少了免疫剂量，即方便操作，也有效降低了免疫注射给猪群造成的应激反应。

焦点二：为何采用大肠杆菌表达系统？

大肠杆菌表达系统是通过DNA重组技术，在大肠杆菌中高效表达编码病原微生物保护性抗原基因的一个表达系统。是目前重组蛋白表达的最常用系统，大肠杆菌表达系统研究的较早，具有背景清楚，操作简便，表达量高等诸多优点。表达水平相对于哺乳动物表达系统来说明显更高，但也有相对应的缺点，如大肠杆菌系统不能将表达蛋白分泌到胞外，二硫键的形成能力有限，不能实现蛋白表达复杂修饰（如糖基化修饰等）。

昆虫杆状病毒表达载体系统是利用携带有外源目的基因的重组昆虫杆状病毒作载体在昆虫体内或昆虫培养细胞进行表达生产的一个重组蛋白生产系统。由于该系统所需要的周期远比动物或植物系统短，可以利用昆虫个体或其培养细胞进行大规模的表达生产，生产的重组蛋白产量高,蛋白翻译后加工比细菌、酵母生产系统完善，而且由于昆虫杆状病毒具有限制性的宿主范围，只对特定种属的昆虫及其细胞进行感染，对人畜等脊椎动物没有感染能力，因此具有比在哺乳动物及其培养细胞生产系统更为安全等优点而成为目前最有效的真核表达系统之一。（表1）

表1 两种表达系统的优势和不足

猪圆环病毒2型疫苗可以采用大肠杆菌表达系统的原因是：猪圆环病毒2型全基因长为1766-1768 bp，为目前已知感染猪群的最小的病毒之一。圆环病毒表面只存在一种结构蛋白（cap蛋白），该蛋白不需要任何糖基化位点修饰，因此采用大肠杆菌表达系统和采用杆状病毒表达系统从根本而言没有任何差别。此外，大肠杆菌表达系统具有操作简便、周期短，成本低等优点，所以在圆环病毒2型Cap蛋白表达时选择大肠杆菌表达系统更具有竞争力。

焦点三：“圆柯欣”有哪些技术突破？

普莱柯生物自2010 年上市国内首个全病毒猪圆环病毒2型灭活疫苗（SH株）之后，长期致力于更高品质圆环系列产品的研究与开发，新上市的猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗“圆柯欣”主要突破在于：突破了可溶性蛋白的表达、高纯度Cap蛋白提取、病毒样颗粒组装3项核心技术。

1）、可溶性蛋白的表达

大肠杆菌表达系统因其自身众多的优点而成为表达外源性蛋白的首选，但是外源蛋白在大肠杆菌表达过程中往往不能正确折叠而形成不溶的无活性蛋白，即包涵体。如何提Cap蛋白的可溶性表达，专家们进行了深入的研究。在丰富的大肠杆菌表达技术储备和完善的载体库与基因库基础上，通过生物信息学统计分析和基因重组克隆技术构建、优化和筛选表达载体，实现该技术的突破，使得可溶性Cap蛋白在大肠杆菌中的表达量有了质的提升。

2）、高纯度Cap蛋白获取

Cap蛋白经过表达、粗纯后，其中仍含有大量大肠杆菌的蛋白、核酸、细胞碎片等杂质，这些杂质会影响病毒样颗粒的形成，导致产生不完整和不规整的颗粒，同时也会影响疫苗的免疫效力。获取高纯度的蛋白是做好疫苗的首要难点之一。

国家兽用药品工程技术研究中心多位专家经过长期研究，通过多重蛋白层析纯化，获得了高纯度的Cap蛋白，将Cap蛋白的纯度提高至95%以上，从而为后续高效的组装完整的病毒样颗粒奠定了基础。（图1,2）

国家兽用药品工程技术研究中心多位专家经过长期研究，通过多重蛋白层析纯化，获得了高纯度的Cap蛋白，将Cap蛋白的纯度提高至95%以上，从而为后续高效的组装完整的病毒样颗粒奠定了基础。

3）、病毒样颗粒组装

获得了最基本的原料，如何将Cap蛋白组装成有效的病毒样粒子是核心技术。在以前的研究中，该难点是很多学者难以逾越的技术屏障。因为组装条件不成熟，疫苗中Cap蛋白主要以单体或多聚体的形式存在或者部分组装后的颗粒与PCV2病毒本身的大小、结构存在差异，即使含量再高，也无法产生很高的抗体，对猪只无法进行高效的保护。

国家兽用药品工程技术研究中心联合新加坡国立大学经过长期的技术攻关，通过切向流超滤等技术在特定的缓冲液中实现组装。动态光散射分析显示将近100%的蛋白都组装成病毒样颗粒。通过投射电镜，我们可以看到组装成VLPs的真实面目：均一、完整的20nm左右的颗粒。（图3）

国内首个纯病毒样颗粒猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗（大肠杆菌源）——“圆柯欣”的上市，将会加速推动猪用疫苗产业进入基因工程时代，在进一步强化普莱柯在猪苗市场竞争优势的同时，引领我国动物疫苗产业技术进步，为我国家畜疫病防控及安全畜产品生产提供强有力的技术和产品支撑。

根据普莱柯生物整理